L’obiettivo primario del nostro progetto è quello di determinare la presenza e di caratterizzare micro e nano particelle in matrici biologiche di pazienti affetti da SSc e soggetti sani per individuare se l’esposizione a polveri è significativamente correlata all’eziopatogenesi della SSc e/o alle sue manifestazioni cliniche.
Dott.ssa Artoni Erica*, Dott. Sighinolfi Gian Luca**
Dott. Michele Colaci***, Dott.ssa Dilia Giuggioli***, Prof. Clodoveo Ferri***
* Dipartimento di Scienze Biomediche, Metaboliche e Neuroscienze
** Dipartimento di Scienze delle Vita
*** UOC e Cattedra di Reumatologia, Universit. di Modena e Reggio Emilia
La Sclerosi Sistemica (SSc), è una malattia cronica del tessuto connettivo caratterizzata da alterazioni del sistema immunitario, disfunzione endoteliale ed accumulo di tessuto fibroso nella cute e negli organi interni, in particolare l’esofago, il tratto gastroenterico, i polmoni, il cuore e il rene. L’eziologia della SSc, ancora sconosciuta, è multifattoriale, ed è il risultato di una complessa interazione fra uno o più fattori ambientali e/o infettivi e una certa predisposizione genetica. Il ruolo delle polveri sottili e ultrasottili di origine ambientale nella etiopatogenesi delle malattie è tutt’ora di grande interesse scientifico ed è ancora ampiamente dibattuto. In virtù delle loro ridotte dimensioni, le micro e nano particelle (NPs) sono in grado di attraversare le barriere biologiche, penetrando nel corpo umano per inalazione, ingestione e via dermica; attraverso il torrente circolatorio e linfatico possono raggiungere molti organi e tessuti, compromettendone le normali funzioni. È stato dimostrato come la presenza di micro e NPs a livello polmonare e cutaneo possa innescare il rilascio di citochine e mediatori pro infiammatori, responsabili di danno endoteliale e/o fibrotico.
Nonostante i numerosi studi epidemiologici pubblicati sul possibile ruolo della silice nello sviluppo della sclerodermia, ad oggi non sono mai stati eseguiti studi sui valori quantitativi di micro e nano polveri metalliche e/o ceramiche utili ad identificare un eventuale limite di esposizione a tale particolato.
L’obiettivo primario del nostro progetto è quello di determinare la presenza e di caratterizzare micro e nano particelle in matrici biologiche di pazienti affetti da SSc e soggetti sani per individuare se l’esposizione a polveri è significativamente correlata all’eziopatogenesi della SSc e/o alle sue manifestazioni cliniche.
Grazie al finanziamento da parte del GILS del nostro progetto di ricerca, è stato effettuato uno studio preclinico monocentrico reclutando cinquanta pazienti affetti da SSc, età media 56±12 anni (35-79), femmine/maschi: 45/11, durata malattia 10±8 anni, afferenti al reparto di Reumatologia del Policlinico di Modena. Tutti i soggetti soddisfano i criteri ACR–Eular del 2013, e risultano residenti nella stessa area geografica (provincia di Modena) da più di 5 anni. Sono stati selezionati anche trenta controlli costituiti da volontari sani provenienti dalla stessa area geografica, comparabili per età e sesso ai pazienti sclerodermici.
Ad ogni soggetto incluso in questo studio retrospettivo è stato sottoposto un questionario anamnestico formulato appositamente per individuare una possibile esposizione ad inquinanti micro e nano dimensionati. Si sono raccolte informazioni cliniche e demografiche, sulla storia occupazionale e residenziale dei soggetti, nonché sulle abitudini al fumo e la presenza di impianti protesici ed odontoiatrici. Un significativo aumento del rischio di SSc è stato associato con l’esposizione occupazionale (OR = 3.167; CI = 1.205 – 8.323). In questa categoria rientrano 38 pazienti su 50, i quali presentano una storia di impiego lavorativo in ceramica o nell’industria chimica, o tessile o delle costruzioni, e sono regolarmente esposti a polveri, vapori o aerosol durante il lavoro quotidiano per un periodo di almeno 5 anni.
Si è operata una scelta per individuare le matrici biologiche più idonee su cui eseguire le analisi per rilevare le micro e NPs inorganiche. Le due principali matrici prese in considerazione sono state il siero, poiché rappresenta il liquido biologico d’elezione per la valutazione dell’esposizione ai metalli ed è normalmente usato sia per lo screening che per il bio-monitoraggio di contaminanti nel medio e nel lungo termine, ed i capelli, poiché sono indicativi dell’esposizione a lungo termine grazie alla loro capacità di accumulare nel tempo xenobiotici quali metalli.
Il siero è stato sottoposto ad analisi ultrastrutturale qualitativa per valutare rispettivamente la presenza di micro e nano particelle: la caratterizzazione morfologica del particolato è stata effettuata mediante Microscopia Elettronica a Scansione Ambientale (ESEM), mentre l’identificazione chimica delle particelle è stata attuata mediante Spettroscopia a raggi X per Dispersione di Energia (EDS).
Un esempio dell’analisi ultrastrutturale condotta sul siero di un paziente sclerodermico impiegato in una ditta ceramica è riportata nella Figura sottostante. L’immagine ESEM mostra un agglomerato di nanoparticelle, mentre la composizione chimica di una di queste, indicata dalla freccia, è restituita dallo spettro EDS riportato sotto.
Il Ti è spesso associato al Si ed è usato nei processi industriali ceramici come sbiancante.
Nei campioni dei pazienti SSc sono state identificate sia micro che nano particelle: il diametro eterogeneo delle particelle rilevate è compreso tra 30 nanometri e 3,9 micrometri. Le particelle sono presenti sia in singola forma che in forma di aggregati micrometrici. La composizione delle polveri sottili riscontrate nei campioni sierici dei pazienti, ottenuta mediante microanalisi EDS, è risultata complessa ed eterogenea.
L’elemento ritrovato con maggior frequenza è il Si che risulta presente nell’86% delle particelle identificate.
La valutazione totale quantitativa degli elementi in traccia presenti nel siero e nei capelli è stata svolta attraverso Spettrometria di Massa al Plasma ad Emissione Atomica (ICP-AES) basandosi sui protocolli approvati dall’Istituto Superiore di Sanità.
La concentrazione degli elementi in traccia (µg/L o ppb) nel siero dei trenta controlli analizzati è stata confrontata quella relativa ai cinquanta pazienti SSc: è stato rilevato un aumento del 105% del Si nel siero dei pazienti SSc rispetto al siero dei controlli. Questi dati indicano per la prima volta un valore quantitativo sierico (324±168 µg/L) significativo di Si nei soggetti affetti da SSc rispetto ai valori di soggetti sani (158±45 µg/L), comparabili per sesso, per età ed estrazione geografica. Tale aumento del silicio è stato confermato dalle analisi sui capelli ottenendo valori d’incremento superiori pari al 326% rispetto ai controlli. Infatti, la quantità media di Si nei campioni di capelli dei pazienti sclerodermici è di 109.54±29.36 µg/g contro i 25.6±9.62 µg/g dei controlli.
Mediante l’analisi quantitativa è stato possibile individuare il Si come l’elemento con la concentrazione maggiore nel siero dei pazienti SSc rispetto ai controlli. Il valore di soglia tra i pazienti positivi e negativi ad una concentrazione significativa di Si è stato definito come tre deviazioni standard sopra il valore medio della popolazione normale (158±45 µg/L) ovvero 293 µg/L. Ventitre dei ventisei pazienti appartenenti al primo gruppo caratterizzato da livelli di silicio superiori al valore soglia rientrano nel gruppo dei pazienti con esposizione occupazionale rilevata attraverso il questionario anamnestico, dimostrando che la classificazione è simile per circa il 90%.
A partire da questa suddivisione, i risultati dell’analisi quantitativa hanno evidenziato un significativo aumento della forma diffusa (P = 0.0324) della SSc tra i pazienti con valori soglia di Si oltre 293 µg/L. I pazienti così selezionati sono caratterizzati inoltre da un aumento di fibrosi polmonare (P = 0.01), di ulcere digitali (P = 0.02) ed un valore più elevato del Rodnan Skin Score (P = 0.01). I nostri dati indicano una minor aspettativa di vita dei soggetti con livelli sierici di Si elevati conseguente alla maggior correlazione con la forma diffusa di SSc, si rileva infatti un significativo calo della durata media della malattia (P = 0,01).
L’analisi quantitativa del siero inoltre evidenzia un aumento della concentrazione di Cr (100%) e del Ti (400%) nei pazienti con sclerodermia rispetto ai controlli e nel caso dei capelli del 33% per il Cr ed del 76% per il Ti. Questo aumento coinvolge valori di poche ppb che potrebbero sovrapporsi alla soglia di sensibilità dello strumento e vanno assunti come significativi con molta prudenza.
Nello studio non sono state rilevate variazioni significative della concentrazione degli elementi in traccia tra maschi e femmine a causa del rapporto sbilanciato a favore delle femmine.
La presenza significativa del Si, in oltre il 65% dei pazienti SSc analizzati, sia in forma particellare che come elemento in traccia nelle matrici biologiche analizzate (siero e capelli) sembrerebbe confermare il sospetto di un ruolo di tale elemento anche nell’eziopatogenesi della SSc. Per verificare la possibile interazione tra nano particelle inorganiche e autoanticorpi è stato condotto un saggio di immunofluorescenza indiretta (IFI) eseguito incubando sieri di pazienti e controlli con NPs di vari tipi e dimensioni. Si è rilevata un’affinità diretta delle particelle di Si e SiTi con la frazione autoanticorpale, nello specifico con gli anticorpi ACA di pazienti sclerodermici.
I risultati del nostro studio hanno mostrato una interessante correlazione fra le informazioni raccolte dall’indagine anamnestica e i risultati ottenuti mediante le metodiche analitiche applicate.
In conclusione i dati dello studio indicano che l’esposizione a polveri ed in particolar modo a silice in forma cristallina micro e nano dimensionata, può essere considerata non solo un probabile fattore eziopatogenetico della malattia ma anche un parametro predittivo di severità clinica nei pazienti con SSc. L’esposizione occupazionale alla polvere di silice cristallina dovrebbe comunque essere attentamente monitorata in tutti i pazienti sclerodermici.
Legenda degli elementi chimici
Si: silicio, Ti: titanio, Cr: cromo.
