Primo Progress Report

Questo progetto di ricerca si propone di verificare un modello patogenetico di sclerodermia (SSc) basato sulla presenza, nel siero dei pazienti affetti da questa malattia, di autoanticorpi diretti contro il recettore del PDGF (PDGFR) presente nella membrana cellulare dei fibroblasti. Questi autoanticorpi attivano i fibroblasti inducendoli a produrre più collageno del normale, contribuendo quindi alla fibrosi tipica della SSc. Il progetto è articolato in tre sottoprogetti indipendenti:

1)  Analisi di espressione delle sequenze CDR (regioni che determinano la complementarietà) degli autoanticorpi anti-PDGFR nell’RNA dei pazienti affetti da sclerodermia e dei controlli.

2) Sviluppo di un saggio di legame in fase solida per la rilevazione di  autoanticorpi anti-PDGFR nel siero.

3) Dimostrazione dell’attività biologica degli autoanticorpi anti-PDGFR in vivo.

Ecco i risultati raggiunti nella prima fase dell’attività di ricerca:

1) Abbiamo messo a punto una metodica molecolare (real-time PCR) in grado di identificare nel sangue un tratto di RNA che codifica per un autoanticorpo anti-PDGFR. Questa sequenza è stata trovata nel sangue di 5 pazienti SSc su 20 analizzati in totale, mentre la stessa non è stata identificata in nessuno dei 20 controlli (10 soggetti sani, 5 affetti da fenomeno di Raynaud, 5 affetti da LES). Questa sequenza di RNA potrebbe rappresentare dunque un possibile biomarker di SSc, che andrà convalidato mediante ampliamento della casistica nella successiva fase del programma di ricerca. Attualmente è anche in corso la ricerca, mediante metodica analoga e nella stessa casistica oggetto di questa prima fase dello studio, di ulteriori sequenze di RNA che codificano per altri autoanticorpi anti-PDGFR.

2) L’obiettivo di questa fase del progetto di ricerca è stato quello di sviluppare un saggio immunoenzimatico (ELISA) in grado di identificare la presenza di autoanticorpi anti-PDGFR nel siero. Abbiamo utilizzato un recettore prodotto nel nostro laboratorio, testando una serie di varianti metodologiche. La metodica migliore è stata impiegata per l’analisi di campioni di siero ottenuti da 22 pazienti SSc e 120 controlli (94 sani e 26 pazienti con altre malattie del tessuto connettivo: 6 con fenomeno di Raynaud primario, 7 con artrite reumatoide e 13 con LES).

La differenza tra il segnale medio ottenuto con i sieri SSc (0.247 ± 0.202 di deviazione standard) e quello ottenuto con i controlli sani (0.107 ± 0.105) è risultata statisticamente significativa (p <0.0001).

I sieri ottenuti dai 26 pazienti con altre malattie hanno dimostrato valori medi più bassi rispetto a quelli dei pazienti SSc (Raynaud primario: 0.237 ± 0.111; artrite reumatoide: 0.147 ± 0.063; LES: 0.152 ± 0.155). La differenza tra il gruppo SSc e quello di controllo non ha però raggiunto la significatività statistica. Calcolato il valore di cut-off come media del segnale del gruppo di controlli sani + due deviazioni standard (0.107 + 0.210 = 0.317), sono stati considerati positivi per la presenza di autoanticorpi anti-PDGFR: 23% (5/22) dei pazienti con SSc, 7% (6/94 campioni) dei controlli sani, 50% dei pazienti con Raynaud (3/6), 0% dei pazienti con AR (0/7), 8% dei pazienti con LES (1/12).

Va però precisato che 2 su 6 pazienti affetti da Raynaud caratterizzati dai due più alti valori di segnale stanno evolvendo verso una franca SSc. Questo dato potrebbe indicare un valore predittivo positivo di questo saggio, molto utile ai fini della diagnosi precoce di SSc, e potrebbe avvalorare il ruolo degli autoanticorpi anti-PDGFR nella patogenesi della SSc.

Nel complesso, questo saggio di legame presenta ancora limiti di sensibilità, che cercheremo di superare mediante l’utilizzo di nuovi preparati recettoriali la cui purificazione è in corso. Verrà inoltre ampliata, come previsto dal programma di ricerca, la casistica sia SSc che delle altre connettiviti, per raggiungere almeno il numero di 100 pazienti ciascuna.

3) L’obiettivo di questa fase del progetto di ricerca è stato quello di espandere la produzione degli anticorpi monoclonali anti-PDGFR, da noi ingegnerizzati partendo dalle sequenze genetiche degli autoanticorpi nativi dei pazienti SSc. Inoltre, abbiamo iniziato la creazione di topi transgenici “umanizzati” nei quali inoculare gli anticorpi monoclonali anti-PDGFR al fine di indurre la SSc in questi animali. Abbiamo purificato alcune centinaia di microgrammi di ciascuno degli otto monoclonali (ivi incluso il controllo negativo) destinati ad essere inoculati nei topi. Per la produzione di topi caratterizzati dall’espressione di PDGFR umano, abbiamo clonato il cDNA del PDGFR umano in un vettore d’espressione. Questo è stato inoculato nei pronuclei di embrioni di topo. Gli embrioni sono stati prelevati all’undicesimo giorno dalla microiniezione, opportunamente processati, e il DNA è stato estratto dal sacco vitellino e sottoposto a screening.

Sono stati ottenuti vari embrioni positivi per il nostro transgene, che verranno utilizzati nelle fasi successive del progetto per ottenere topi adulti caratterizzati da espressione di PDGFR umano.

Nel complesso, i dati ottenuti in questa prima fase del progetto di ricerca sembrano corroborare il razionale del progetto stesso, e lasciano ben sperare che la conferma di questo modello patogenetico di SSc possa aprire la strada allo sviluppo di nuovi strumenti per la diagnosi precoce e la terapia mirata di questa malattia.