Dr. Gianluca Moroncini

Introduzione

La sclerosi sistemica o sclerodermia è un disordine del tessuto connettivo clinicamente eterogeneo caratterizzato da manifestazioni vascolari, immuno-infiammatorie e fibrotiche. Il progresso della conoscenza dei meccanismi responsabili dell’eccessiva produzione di collageno da parte dei fibroblasti sclerodermici e l’identificazione di nuovi biomarker di malattia sono due prerequisiti necessari a migliorare la gestione clinica dei pazienti affetti da questa malattia.

Questo progetto di ricerca si propone di verificare un modello patogenetico proposto negli scorsi anni dal gruppo di ricerca del Prof. Armando Gabrielli, Università Politecnica delle Marche, Ancona. Tale modello di malattia si basa sulla presenza, nel siero dei pazienti affetti da sclerodermia, di anticorpi diretti contro il recettore del PDGF (PDGFR) presente nella membrana cellulare dei fibroblasti. Questi anticorpi hanno la proprietà di attivare i fibroblasti inducendoli a produrre più collageno del normale, contribuendo quindi alla fibrosi tipica della sclerodermia.

Dati preliminari

Abbiamo isolato dal sangue periferico di due pazienti affetti da sclerodermia cloni di linfociti B che producono anticorpi stimolatori diretti contro il PDGFR. Abbiamo analizzato le sequenze genetiche che codificano per tali anticorpi e le abbiamo ingegnerizzate per produrre anticorpi monoclonali umani diretti contro il PDGFR. Alcuni di questi anticorpi monoclonali, da noi generati sulla base delle sequenze genetiche identificate nei linfociti dei pazienti sclerodermici, hanno le caratteristiche precedentemente individuate negli anticorpi totali purificati dal siero dei pazienti, cioè si legano al PDGFR presente nei fibroblasti umani e stimolano i fibroblasti umani a produrre più collageno del normale.

Inoltre, abbiamo sintetizzato in laboratorio un recettore del PDGF che ha la stessa conformazione del recettore nativo presente nei fibroblasti umani. Immobilizzando questo recettore artificiale ad una matrice attiva (biosensore), abbiamo dimostrato che è in grado di legare selettivamente gli anticorpi purificati dal siero dei pazienti affetti da sclerodermia e non quelli purificati dal siero di soggetti sani o affetti da fenomeno di Raynaud.

Obiettivi del progetto di ricerca

I tre obiettivi del progetto di ricerca verranno perseguiti mediante tre attività di ricerca indipendenti.

1)  Analisi di espressione delle sequenze CDR (complementarity-determining regions) degli autoanticorpi anti-PDGFR nell’RNA dei pazienti affetti da sclerodermia e dei controlli.

All’interno del pannello di anticorpi monoclonali anti-PDGFR che abbiamo generato, alcune sequenze delle regioni variabili appaiono specifiche dei due pazienti sclerodermici di cui abbiamo analizzato il repertorio immunitario. Infatti, le sequenze di DNA che codificano per tali regioni anticorpali non sono già note in quanto non presenti in alcuna banca dati genetica attualmente disponibile. Pertanto il nostro obiettivo sarà quello di verificare che l’informazione genetica per queste particolari regioni, chiamate regioni che determinano la complementarietà (complementarity-determining regions, CDR), sia presente nell’RNA messaggero estratto dal sangue dei pazienti sclerodermici, ma non in quello dei controlli. L’identificazione di differenze significative tra i due gruppi costituirebbe non solo una validazione indipendente del modello patogenetico oggetto del progetto di ricerca, ma anche un nuovo test di screening in caso di sospetto clinico di sclerodermia (pazienti con fenomeno di Raynaud e/o “puffy finger” o altre manifestazioni cliniche correlabili a sclerodermia). Sono state disegnate due strategie sperimentali alternative: i) il saggio QuantiGene 2.0 che si basa sull’ibridazione di specifiche sonde oligonucleotidiche all’RNA bersaglio, con la successiva amplificazione e rilevazione del segnale mediante un dispositivo Multiplex che è disponibile nel nostro laboratorio; ii) un saggio in PCR real-time secondo metodica TaqMan, che è stata già utilizzata per altri geni d’interesse nel nostro laboratorio.

Risultati attesi:

–  un metodo affidabile per quantificare l’espressione di geni per i CDR degli autoanticorpi anti-PDGFR nell’RNA dei pazienti e dei controlli

–  verifica del concetto di autoimmunità anti-PDGFR quale meccanismo patogenetico di sclerodermia

2) Sviluppo di un saggio di legame in fase solida per la rilevazione di  autoanticorpi anti-PDGFR nel siero.

Il recettore del PDGF generato nel nostro laboratorio e rivelatosi in grado di legare selettivamente gli anticorpi purificati dal siero dei pazienti affetti da sclerodermia, verrà utilizzato per mettere a punto un saggio immunoenzimatico (ELISA) di cattura, al fine di discriminare i sieri dei pazienti sclerodermici dai sieri dei controlli. Le informazioni (soluzioni tampone, pH, concentrazioni di lavoro) ottenute durante la messa a punto del saggio al biosensore potranno essere trasferite alla piattaforma ELISA al fine di raggiungere la conformazione recettoriale ideale riconosciuta dagli autoanticorpi anti-PDGFR contenuti nel siero dei pazienti sclerodermici.

Il nostro laboratorio possiede un’ampia banca biologica contenente circa 100 sieri di pazienti sclerodermici e 100 sieri di controlli (fenomeno di Raynaud idiopatico, connettivite indifferenziata, lupus, artrite reumatoide, fibrosi polmonare idiopatica, sani), oltre alle attrezzature necessarie alla metodica ELISA.

Risultati attesi:

–  un saggio efficace, riproducibile e a basso costo per la rilevazione di  autoanticorpi anti-PDGFR nel siero

–  verifica del concetto di autoimmunità anti-PDGFR quale meccanismo patogenetico di sclerodermia

3) Dimostrazione dell’attività biologica degli autoanticorpi anti-PDGFR in vivo.

Il razionale di questo obiettivo è quello di dimostrare che gli anticorpi monoclonali, da noi ingegnerizzati partendo dalle sequenze genetiche degli autoanticorpi anti-PDGFR nativi dei pazienti sclerodermici, sono in grado di indurre il fenotipo sclerodermico in animali da esperimento.

A tal fine, verrà generato un nuovo modello di topo transgenico “umanizzato” caratterizzato dalla doppia espressione di PDGFR e sistema immunitario umani. Gli anticorpi monoclonali anti-PDGFR dotati di attività biologica in vitro, ed anticorpi controllo prodotti con la stessa metodica ma diretti contro antigeni irrilevanti, verranno iniettati in vena cronicamente con dosaggio e tempistica da ottimizzare in vivo. I topi verranno osservati quotidianamente per valutare la comparsa di ispessimento cutaneo o di altre manifestazioni di sclerodermia. Dopo il sacrificio, la cute, l’endotelio microvascolare e gli organi interni verranno esaminati istologicamente per valutare la fibrosi, l’ispessimento dell’intima vasale ed altre lesioni tipiche del fenotipo sclerodermico umano.

Risultati attesi:

–  un nuovo modello animale di sclerodermia

–  verifica del concetto di autoimmunità anti-PDGFR quale meccanismo patogenetico di sclerodermia

Conclusione

Abbiamo disegnato un piano sperimentale basato su tre studi paralleli e indipendenti guidati dalla stessa ipotesi. Ogni braccio sperimentale è finalizzato a validare rigorosamente il nuovo modello patogenetico di sclerodermia incentrato sulla presenza di autoanticorpi diretti contro il recettore del PDGF. Pensiamo che i dati preliminari recentemente prodotti nel nostro laboratorio corroborino il razionale di questo progetto di ricerca e che la conferma di questo fattore causale di sclerodermia possa aprire la strada allo sviluppo di strumenti per la diagnosi precoce e di terapie mirate contro questa malattia. In effetti, il raggiungimento di ciascuno dei tre obiettivi, indipendentemente dal buon esito degli altri due, potrà produrre nuovi strumenti scientifici utili per la pratica clinica, ad esempio nuovi saggi diagnostici e di monitoraggio (obiettivi 1 e 2), ed un nuovo modello animale di sclerodermia (obiettivo 3) utile per la valutazione pre-clinica di terapie innovative.