Dr. Stefania Lenna Fondazione IRCCS “Ca’ Granda – Ospedale Maggiore Policlinico Milano Division of Rheumatology, Boston University, Boston USA PROGRESS REPORT- 1a PARTE )

Questo progetto di ricerca si propone di deterninare i meccanismi molecolari che
mediano l’ effetto dell’ antigene HLA-B35 sulle cellule endoteliali, antigene
risultato associato alla Ipertensione Polmonare (PHT) in pazienti Sclerodermici
(SSc) italiani.
Gli obbiettivi di questo studio sono:
1. Caratterizzare le conseguenze biologiche dell espressione dell’ antigene HLAB35
nelle cellule endoteliali.
2. Determinare se HLA-B35 induce ER stress nelle cellule endoteliali.
3. Determinare le interazioni proteiche con HLA-B35 usando gel elettroforetico
2D e Spettrometria di Massa.
Inizialmente ci siamo concentrati nel studiare come HLA-B35 puo’ contribuire al
“mal funzionamento” delle cellule endoteliali via ER stress mediando la
produzione di endotelina 1 (ET1) nei pazienti con PHT basata su dati ottenuti
mediante array analisi sono state evidenziate significative variazioni nell’
espressione di geni dello “stress del Reticolo Endoplasmatico” (ER stress) e
della conseguente “UPR response” (risposta alla non corretta conformazione
delle proteine).
Nelle cellule endoteliali abbiamo recentemente dimonstrato che l’ espressione
dell’ antigene HLA-B35 risulta in un significativo aumento dell’ endotelina 1 e
significativo diminuzione di eNOS sia a livello dell’ RNA che proteico. Inoltre, l’
HLA-B35 aumenta l’ espressione delle Heat Shock Proteins, HSP70 e HSP40,
suggerendo che l’antigene HLA-B35 induca ER stress e UPR (Unfolded Protein
Response) nelle cellule endoteliali.
Ulteriore conferma e’ il fatto che HLA-B35 induce persistente aumento di BiP,
una proteina residente nel reticolo endoplasmatico e considerato il “master”
regolatore dell’UPR. Proteine non correttamente o non completamente
assemblate si legano a Bip sequestrandolo dal legame con i tre principali
induttori dell’ UPR: IRE1, PERK e ATF6. Altri geni dell UPR (CHOP, ERO1 and
PDI) non subiscono variazioni. L’osservazione che l’ antigene HLA-B35 possa
contribuire al disfunziomento delle cellule endoteliali via ER stress mediando
induzione di ET-1, suggerisce la possibilita’ che un meccanismo simile possa
avvenire nei pazienti con PHT.
Altri geni risultarono significativamente aumentati dall’ HLA-B35 nelle cellule
endoteliali, per esempio geni dell’ interferone pathway, geni dell’ infiammazione,
chemochine e interleuchine, altri geni come quelli del ciclo cellulare invece
erano diminuiti.
Comunque, in contrasto con espressione di ET-1 e eNOS, che erano
consistentemente alterati in tutte le linee cellulari analizzate, abbiamo potuto
convalidare i geni relativi all’ interferone solo in alcune line cellulari, suggerendo
che altri fattori genetici possono avere specifici effetti sulla risposta dell’ HLA-B35
in cellule endoteliali.
Precedentemente e’ stato dimostrato la presenza di attivazione dell’ inferferone e
dell’ infiamamzione in pazienti sclerodermici; abbiamo cosi deciso di testare
alcuni geni dell interferone (IFIT1 e MX1) nelle cellule del sangue di pazienti
sclerodermici con e senza PHT.
Entrambi questi geni sono risultati espressi ad alti livelli in pazienti SSc e quando
abbiamo analizzato i pazienti per la presenza dell’ allele HLA-B35, abbiamo
notato una maggiore espressione di questi geni in pazienti SSc-PHT positivi per
HLA-B35. Abbiamo poi testato i geni dell’ ER stress/UPR negli stessi campioni,
osservando una significativa elevata espressione di questi geni nei pazienti SSc.
In modo particolare alcuni geni dell’ ER stress/UPR includendo BiP, DNAJB,
ATF4, e ATF6, mostrarono alti livelli di espressione nei pazienti con PHT,
suggerendo che ER stress/UPR puo’ avere un ruolo patologico nel processo
evolutivo della malattia. Interessante e’ stato notare che anche nei campioni di
individui sani e portatori dell’ antigene HLA-B35 presentavano espressione dei
geni dell’ ER stress/UPR, ribadendo il fatto che fattori genetici possano
influenzare il livello di ER stress in una determinata sottopopolazione di pazienti.
Sempre piu’ evidenze suggeriscono il ruolo dell’ infiammazione nello sviluppo e/o
decorso dell’ PHT ed elevati liveli di mediatori dell’ infiammazione sono stati
osservati nel plasma di pazienti con PHT, per esempio interleuchina 6 (IL6).
Abbiamo potuto confermare significativi elevati livelli di IL6 nelle cellule del
sangue di pazienti Sclerodermici, in particolar modo in pazienti con PHT. Inoltre
abbiamo trovato una positiva e significativa correlazione tra BiP (cosi come tra
altri marker dell’ ER stress) e i livelli di IL-6 , supportando l’idea che ER stress
possa avere un ruolo diretto nel’ induzione dell’ infiammazione.
Questi risultati dimostrano una forte associazione tra l’ attivazione dei geni dell
ER stress/UPR e SSc-PHT suggerendo che ER stress/UPR possa alterare le
funzioni delle cellule immunitarie circolanti nei pazienti con SSc dando ulteriore
supporto al ruolo patogenico dell’ antigene HLA-B35 in SSc-PHT.
Recenti pubblicazioni hanno mostrato che il sistema immunitario innato regola l’
infiammazione e fibrosi a livello del derma in SSc attraverso i Toll-Like receptor
(TLR) nei fibroblasti. Abbiamo cosi deciso di testare se ci fosse un legame tra la
presenza dell’antigene HLA-B35, attivazione dei TLR e infiammazione. Studio in
corso ha rivelato che nelle cellule endoteliali l’ antigene HLA-B35 sinergizza con
attivazione dei TLR nell’ aumento di citochine e chemochine.
Inoltre dati preliminari dimostrano che l’ attivazione dell’ ER stress/UPR coopera
con alcuni TLR inducendo i geni dell’ inflammazione nelle cellule endoteliali,
suggerendo che ER stress/UPR e l’ attivazione dei signali attraverso i TLR puo’
contribuire alla disfunzione delle cellule endoteliali nella Sclerodermia.
In base a queste nuove osservazioni abbiamo proposto la seguente ipotesi: ER
stress/UPR gioca un ruolo patogenico in SSc-PHT sensibilizzando le cellule
endoteliali e immunitarie verso i TLR risultando in un aumento della risposta
infiammatoria. La presenza dell’ antigene HLA-B35 puo’ inoltre intensificare il
processo della malattia contribuendo alla disfunzione delle cellule endoteliali,
cosi come attivando il sistema imunitario in pazienti con PHT.
STUDI FUTURI:
In base a queste osservazioni abbiamo ipotizzato che HLA-B35 puo’
direttamente influenzare il decorso della malattia non solo attraverso il mal
funzionamento delle cellule endoteliali ma anche attivando il sistema immunitario
in patienti con PHT.
Per testare la nostra ipotesi e per approfondire gli effetti dell’ antigene HLA-B35 ,
proponiamo i seguenti punti di approfondimento:
Punto 1 (in corso). Investigare le conseguenze funzionali dell’ espressione dell’
antigene HLA-B35 nelle cellule endoteliali.
Esp. 1: determinare effetti dell’ HLA-B35 sull’ attivazione dei diversi
segnali cellulari
Esp. 2: caratterizzare effetti dell’ HLA-B35 sulla funzione delle cellule
endoteliali (in corso)
Punto 2 (in corso). determinare il ruolo dell’ ER stress/UPR e HLA-B35 nelle
funzioni delle cellule endoteliali
Esp 1: caratterizzare quale via dell UPR e’ attivata da HLA-B35
Esp 2 : caratterizzare effetti dell, ER stress e HLA-B35 sulle funzioni
angiogeniche delle cellule endoteliali
Esp 2: determinare effetti dell’ ER stress/UPR sui TLR nella risposta delle
cellule endoteliali
Esp 3: determinare i segnali cellulari coinvolti nel cross-talk tra ER stress
e TLR
Pubblicazioni 2010
Lenna S, Townsend DM, Tan FK, Kapanadze B, Markiewicz M, Trojanowska M,
Scorza R. HLA-B35 upregulates endothelin-1 and downregulates endothelial
nitric oxide synthase via endoplasmic reticulum stress response in endothelial
cells. J Immunol. 2010; 184 (9): 4654-61.
Lenna S., Farina G. A., Christmann R. B., Farber H. W., Scorza R., Lafyatis R.,
Trojanowska M. Increased expression of endoplasmic reticulum stress genes in
patients with limited Systemic Sclerosis and Pulmonary Arterial Hypertension:
Association with HLA-B35. (spedito a A&R)
Lenna S. and Trojanowska M. “Functional interaction between ER stress/UPR
and TLR ligands promotes inflammation in endothelial cells” Abstract al
Scleroderma Workshop presso Boston University, Agosto 2010