Dr. Stefania Lenna

Fondazione IRCCS “Ca’ Granda – Ospedale Maggiore Policlinico Milano
Division of Rheumatology, Boston University, Boston USA

 

PROGRESS REPORT- 1a PARTE

Questo progetto di ricerca si propone di determinare i meccanismi molecolari che mediano l’ effetto dell’ antigene HLA-B35 sulle cellule endoteliali, antigene risultato associato alla Ipertensione Polmonare (PHT) in pazienti Sclerodermici (SSc) italiani.
Gli obbiettivi di questo studio sono:
1. Caratterizzare le conseguenze biologiche dell’espressione dell’ antigene HLA-B35 nelle cellule endoteliali.
2. Determinare se HLA-B35 induce ER stress nelle cellule endoteliali.
3. Determinare le interazioni proteiche con HLA-B35 usando gel elettroforetico 2D  e Spettrometria di Massa.

Inizialmente ci siamo concentrati nel studiare come HLA-B35 può contribuire al “mal funzionamento” delle cellule endoteliali via ER stress mediando la produzione di endotelina 1 (ET1) nei pazienti con PHT basata su dati ottenuti mediante array analisi sono state evidenziate significative variazioni nell’ espressione di geni dello “stress del Reticolo Endoplasmatico” (ER stress) e della conseguente “UPR response” (risposta alla non corretta conformazione delle proteine).
Nelle cellule endoteliali abbiamo recentemente dimostrato che l’ espressione dell’ antigene HLA-B35 risulta in un significativo aumento dell’ endotelina 1 e significativo diminuzione di eNOS sia a livello dell’ RNA che proteico.  Inoltre, l’ HLA-B35 aumenta l’ espressione delle Heat Shock Proteins, HSP70 e HSP40, suggerendo che l’antigene HLA-B35 induca ER stress e UPR (Unfolded Protein Response) nelle cellule endoteliali.
Ulteriore conferma e’ il fatto che HLA-B35 induce persistente aumento di BiP, una proteina residente nel reticolo endoplasmatico e considerato il “master” regolatore dell’UPR. Proteine non correttamente o non completamente assemblate si legano a Bip sequestrandolo dal legame con i tre principali induttori dell’ UPR: IRE1, PERK e ATF6. Altri geni dell UPR (CHOP, ERO1 and PDI) non subiscono variazioni. L’osservazione che l’ antigene HLA-B35 possa contribuire al disfunziomento delle cellule endoteliali via ER stress mediando induzione di ET-1, suggerisce la possibilità che un meccanismo simile possa avvenire nei pazienti con PHT.

Altri geni risultarono significativamente aumentati dall’ HLA-B35 nelle cellule endoteliali, per esempio geni dell’ interferone pathway, geni dell’ infiammazione, chemochine  e interleuchine, altri geni come quelli del ciclo cellulare invece erano diminuiti.
Comunque, in contrasto con espressione di ET-1 e eNOS, che erano consistentemente alterati in tutte le linee cellulari analizzate, abbiamo potuto convalidare i geni relativi all’ interferone  solo in alcune linee cellulari, suggerendo che altri fattori genetici possono avere specifici effetti sulla risposta dell’ HLA-B35 in cellule endoteliali.
Precedentemente e’ stato dimostrato la presenza di attivazione dell’ interferone e dell’ infiammazione in pazienti sclerodermici; abbiamo cosi deciso di testare alcuni geni dell interferone (IFIT1 e MX1) nelle cellule del sangue di pazienti sclerodermici con e senza PHT.
Entrambi questi geni sono risultati espressi ad alti livelli in pazienti SSc e quando abbiamo analizzato i pazienti per la presenza dell’ allele HLA-B35, abbiamo notato una maggiore espressione di questi geni in pazienti SSc-PHT positivi per HLA-B35. Abbiamo poi testato i geni dell’ ER stress/UPR negli stessi campioni, osservando una significativa elevata espressione di questi geni nei pazienti SSc. In modo particolare alcuni geni dell’ ER stress/UPR includendo BiP, DNAJB, ATF4, e ATF6, mostrarono alti livelli di espressione nei pazienti con PHT, suggerendo che  ER stress/UPR puo’ avere un ruolo patologico nel processo evolutivo della malattia. Interessante e’ stato notare che anche nei campioni di  individui sani e portatori dell’ antigene HLA-B35 presentavano espressione dei geni dell’ ER stress/UPR, ribadendo il fatto che fattori genetici possano influenzare il livello di ER stress in una determinata sottopopolazione di pazienti.

Sempre più evidenze suggeriscono il ruolo dell’ infiammazione nello sviluppo e/o decorso dell’ PHT ed elevati livelli di mediatori dell’ infiammazione sono stati osservati nel plasma di pazienti con PHT, per  esempio interleuchina 6 (IL6).
Abbiamo potuto confermare significativi elevati livelli di IL6 nelle cellule del sangue di pazienti Sclerodermici, in particolar modo in pazienti con PHT. Inoltre abbiamo trovato una positiva e significativa correlazione tra BiP (cosi come tra altri marker dell’ ER stress) e i livelli di  IL-6 , supportando l’idea che ER stress possa avere un ruolo diretto nel’ induzione dell’ infiammazione.
Questi risultati dimostrano una forte associazione tra l’ attivazione dei geni dell ER stress/UPR e SSc-PHT suggerendo che ER stress/UPR possa alterare le funzioni delle cellule immunitarie circolanti nei pazienti con SSc dando ulteriore supporto al  ruolo patogenico dell’ antigene HLA-B35 in SSc-PHT.

Recenti pubblicazioni hanno mostrato che il sistema immunitario innato regola l’ infiammazione e fibrosi a livello del derma in SSc attraverso i Toll-Like receptor (TLR) nei fibroblasti. Abbiamo cosi deciso di testare se ci fosse un legame tra la presenza dell’antigene HLA-B35, attivazione dei TLR e infiammazione. Studio in corso ha rivelato che nelle cellule endoteliali l’ antigene HLA-B35 sinergizza con attivazione dei TLR nell’ aumento di citochine e chemochine.
Inoltre dati preliminari dimostrano che l’ attivazione dell’ ER stress/UPR coopera con alcuni TLR inducendo i geni dell’ infiammazione nelle cellule endoteliali, suggerendo che ER stress/UPR e l’ attivazione dei segnali attraverso i TLR può contribuire alla disfunzione delle cellule endoteliali nella Sclerodermia.

In base a queste nuove osservazioni abbiamo proposto la seguente ipotesi: ER stress/UPR gioca un ruolo patogenico in SSc-PHT sensibilizzando le cellule endoteliali e immunitarie verso i TLR risultando in un aumento della risposta infiammatoria. La presenza dell’ antigene HLA-B35 può inoltre intensificare il processo della malattia contribuendo alla disfunzione delle cellule endoteliali, cosi come attivando il sistema immunitario in pazienti con PHT.

STUDI FUTURI:
In base a queste osservazioni abbiamo ipotizzato che HLA-B35 può direttamente influenzare il decorso della malattia non solo attraverso il mal funzionamento delle cellule endoteliali ma anche attivando il sistema immunitario in pazienti con PHT.
Per testare la nostra ipotesi e per approfondire gli effetti dell’ antigene HLA-B35 , proponiamo i seguenti punti di approfondimento:

Punto 1 (in corso). Investigare le conseguenze funzionali dell’ espressione dell’ antigene HLA-B35 nelle cellule endoteliali.
Esp. 1: determinare effetti dell’ HLA-B35 sull’ attivazione dei diversi segnali cellulari
Esp. 2: caratterizzare effetti dell’ HLA-B35 sulla funzione delle cellule endoteliali (in corso)

punto 2 (in corso).  determinare il ruolo dell’ ER stress/UPR e HLA-B35 nelle funzioni delle cellule endoteliali
Esp 1: caratterizzare quale via dell’ UPR e’ attivata da HLA-B35
Esp 2 : caratterizzare effetti dell’ ER stress e HLA-B35 sulle funzioni angiogeniche delle  cellule endoteliali
Esp 2: determinare effetti dell’ ER stress/UPR sui TLR nella risposta delle cellule endoteliali
Esp 3: determinare i segnali cellulari coinvolti nel cross-talk tra ER stress e TLR

Pubblicazioni 2010

Lenna S, Townsend DM, Tan FK, Kapanadze B, Markiewicz M, Trojanowska M, Scorza R. HLA-B35 upregulates endothelin-1 and downregulates endothelial nitric oxide synthase via endoplasmic reticulum stress response in endothelial cells. J Immunol. 2010; 184 (9): 4654-61.

Lenna S., Farina G. A., Christmann R. B., Farber H. W., Scorza R., Lafyatis R., Trojanowska M. Increased expression of endoplasmic reticulum stress genes in patients with limited Systemic Sclerosis and Pulmonary Arterial Hypertension: Association with HLA-B35.  (spedito a  A&R)

Lenna S. and Trojanowska M. “Functional interaction between ER stress/UPR and TLR ligands promotes inflammation in endothelial cells” Abstract al Scleroderma Workshop presso Boston University, Agosto 2010